Mittlerweile ist die Anzahl von Forschungsarbeiten, die die Funktion eines bestimmten Gens in einem bestimmten Modellorganismus und unter bestimmten Bedingungen beschreiben, unüberschaubar geworden. Dass allerdings Arbeiten veröffentlicht werden, die einen komplett neuen zellulären Mechanismus beschreiben, der vielleicht in allen tierischen und pflanzlichen Zellen abläuft, uns aber bislang verborgen blieb, das ist wirklich selten. Deswegen sind die beiden Artikel, die letzte Woche in der Fachzeitschrift Nature erschienen sind, auch etwas besonderes. Und um zu verstehen, was sie so besonders macht, müssen wir uns ein Paradox der Genetik vor Augen führen, dass sich über die letzten Jahre immer stärker präsentiert hat.

Gentechnische Methoden wie beispielsweise CRISPR erlauben heutzutage das gezielte Mutieren eines Gens, sodass die Funktion des codierten Proteins vollständig verloren geht; man spricht dann von einem knock-out. Andere Verfahren, wie zum Beispiel die Anwendung von RNA Interferenz, erlauben das Herunterregulieren der Genfunktion indem sie die mRNA, also die Abschrift des entsprechenden Gens blockieren oder ihren Abbau einleiten. Dadurch wird die Translation dieser mRNA Moleküle gestört, sodass sehr viel weniger des entsprechenden Proteins gebildet wird. Dabei bleiben in der Regel aber ein paar funktionsfähige Moleküle übrig, weswegen man von knock-down Verfahren redet. Absurderweise wurde aber mehrmals beobachtet, dass diese knock-down Ansätze zu einem stärkeren Effekt führen, als die davor genannten knock-out Ansätze, die doch zu einem vollständigen Verlust des untersuchten Proteins führen. Wie ist das möglich? Das gesamte Forschungsfeld stand vor einem Rätsel…

Was sind non-sense Mutationen?

Um die Funktion eines bestimmten Gens genauer zu untersuchen, macht man es gerne kaputt um zu sehen, welche Auswirkungen dies auf das untersuchte System hat. Dazu bedient man sich im 21. Jahrhundert gerne CRISPR oder andere Nukleasen, die man gezielt gegen einen bestimmten Sequenzabschnitt des Gens richten kann. Hierbei wählt man natürlich gerne einen Bereich, der relativ zu Beginn der codierenden Sequenz liegt. Damit sind jene Abschnitte gemeint, die in Form des berühmten Tripletcodes direkt den Plan zum Bau eines Proteins darstellen. Der Tripletcode und daher das sogenannte Leseraster ist immer durch das Start-Codon ATG festgelegt, das heißt ab dieser Abfolge von ATG wird der folgende Teil des Gens immer in Drei-Buchstaben-Wörtern abgelesen. Wenn man eine programmierbare Nuklease nun auf so einen Sequenzabschnitt loslässt, dann führt das oft zum Verlust einiger weniger Buchstaben. Das kann auf das Leseraster einen gewaltigen Einfluss haben. Dazu ein Beispiel. Schauen wir uns folgenden (zugegebenermaßen nur mäßig sinnvollen) Text an:

the fat cat sat top mat and big dog ran bit

Dabei steht das “the” nun stellvertretend für das ATG und gibt daher das Leseraster vor, d.h. von dort an werden immer drei Buchstaben als Wort aufgefasst. Wenn wir nun eine Mutation vorliegen haben (z.B. erzeugt durch CRISPR), bei der uns nur das C von „cat“ verloren gegangen ist, dann ändert das unseren schönen kleinen Text wie folgt:

the fat ats att opm ata ndb igd ogr anb it

Das kleine bisschen Sinn, welches wir dem Text vorher vielleicht noch entnehmen konnten ist nun völlig verschwunden. In so einem Fall reden wir von einer missense Mutation, da die Triplets, die der Mutation folgen, nun für komplett verschiedene Aminosäuren codieren und das Proteinprodukt des mutierten Gens nichts mehr mit dem Produkt des nicht-mutierten Gens zu tun hat.

Nun gibt es im genetischen Code aber nicht nur das Start-Codon ATG, sondern auch STOP Codons und zwar sogar drei Stück: UAG, UAA und UGA. Alles drei dieser Triplets signalisieren also den Ribosomen, den Proteinfabriken, ihre Arbeit einzustellen und die Proteinkette hier abzuschließen. Nahmen wir an in unserer Katzentextgenetik wären BIT und ATA solche STOP Codons. Unsere Mutation, der Verlust des einzelnen Cs hat dann also dazu geführt, dass unser mutiertes Protein stark verkürzt ist, weil in dem mutierten Leseraster relativ rasch ein ATA auftaucht. In diesem Fall würden wir das ATA als premature STOP Codon bezeichnen und Mutationen, die solche premature STOP Codons hervorrufen, nennen wir non-sense Mutationen.

Mutationen erzeugen mit CRISPR

Solche non-sense Mutationen können entweder natürlichen Ursprung haben, oder jemand hat zu Forschungszwecken „nachgeholfen“ und in Zellkultur oder einem Modelltier eine Mutation eingebracht. Dabei muss man eigentlich nur die Wahrscheinlichkeit für sich arbeiten lassen. Eine CRISPR System beispielsweise oder zusätzlichen Schnick-Schnack erzeugt auf der DNA erstmal einen Doppelstrangbruch. Dieser kann von der Zelle reparaiert werden, wobei aber häufig kleine Fehler passieren. Ziemlich zufällig gehen dabei dann entweder ein Paar Basenpaar verloren oder es kommen ein paar dazu. Jede dieser Deletionen oder Insertionen, die aus genau drei oder einem vielfachen von drei Basenpaar bestehen verändern dabei zwar einzelne Aminosäuren aber sie verschieben das Leseraster nicht, weswegen das Protein meistens noch relativ funktionsfähig ist. Bei zwei Dritteln der Deletionen bzw. Insertionen (zusammen auch gerne „Indels“ genannt) allerdings verschiebt sich das Leseraster, womit wir es auf jeden Fall schon einmal mit einer missense Mutation zu tun haben. Die Wahrscheinlichkeit das dabei nach einer nicht allzu hohen Anzahl von Triplets auch ein STOP Codon dabei ist, ist ziemlich hoch. Zellen in denen es so zu einer non-sense Mutation kam, werden dann gerne selektiert um an ihnen im Detail den Funktionsverlust des entsprechenden Gens („knock-out“) zu studieren.

Diese Art der Erzeugung von Mutationen ist tatsächlich erst in den letzten ein bis zwei Jahrzehnten möglich geworden. Davor hatte man sich anderer Techniken bedient, die aber oft ein Gen nur stark herunterregulieren können und es nicht komplett ausschalten können. Das Forschungsfeld war also begeistert von der Möglichkeit, nun viel klarere und stärkere Effekte zu sehen, dadurch dass sie das Gen komplett lahmlegen können. Nunja, oft war allerdings das Gegenteil der Fall. Der knock-down führt oft zu dramatischeren Effekten als der knock-out. Wie kann das sein?

Non-sense mediated mRNA decay

Der erste Schritt zum Verständnis dieses Paradox besteht in non-sense mediated mRNA decay (oder kurz NMD). In Säugetieren wird die meisten sogenannten primär-Transkripte also eine RNA-Rohfassung der Abschrift eines Gens ja erst im Zellkern gesplict, bevor sie ins Zytoplamsa transportiert werden, wo sie als Vorlage für den Bau des Proteins dienen. Beim Splicen werden bestimmte Teile des primär-Transkripts, Introns, entfernt und die verbleibenden Exons, die die codierende Sequenz enthalten, zusammengefügt. Dabei bleiben an all jenen Stellen, an denen Introns entfernt wurden kleine Proteinkomplexe an den Exon-Verbindungsstellen zurück. Diese Proteinkomplexe, sogenannte Exon Junction Complexes (EJCs), werden direkt nachdem die RNA den Kern verlässt von anderen Proteinen, so genannten up-frameshift (Upf) Proteinen, erkannt und gebunden. In einer ersten Runde der Translation, also im Ablesen der RNA durch das Ribosom verbunden mit der Proteinsynthese, werden dann alle EJCs entfernt über die das Ribosom drüberfährt. Das Ribosom fällt erst beim Erkennen eines STOP Codons von der RNA herunter und beendet die Proteinsynthese. Im Normalfall taucht so ein STOP Codon erst im letzten Exon auf; dahinter liegen also keine EJCs mehr. Sollte das Ribosom aber durch ein premature STOP codon von der RNA abfallen, dann schubst es die dahinter liegenden EJCs nicht herunter. EJCs die auf der RNA bleiben, rekrutieren allerdings ziemlich rasch die RNA-Abbaumaschinerie. Die non-sense Mutation (sofern sie nicht ausgerechnet im letzten Exon liegt) führt also dazu, dass die RNA sehr instabil ist und rasch abgebaut wird.

So weit, so gut. Der NMD Mechanismus war schon seit geraumer Zeit bekannt, aber mit ihm allein kann man noch nicht erklären, warum die Mutation zu einem schwächeren Phänotyp führt als der knock-down. Und nun kommen wir zu den beiden Arbeiten, die kürzlich in Nature erschienen sind.

NMD induziert genetische Kompensation

Die beiden neuen Artikel (nochmal: hier und hier) haben zum aufgezeigt, dass das Rekrutieren der RNA-Abbaumaschinerie nicht das einzige ist, was die Upf Proteine tun. Denn wenn die RNA zerlegt wird, schnappt sich eines dieser Proteine, Upf3a, noch ein Stückchen davon und reist zurück in den Zellkern. Dort arbeitet es zusammen mit einem großen Proteinkomplex namens COMPASS. COMPASS spielt eine wichtige Rolle bei der epigenetischen Modifikation der DNA, genauer gesagt verpasst dieser Komplex den Promoterregionen von Genen, die abgelesen werden sollen eine bestimmte chemische Markierung. COMPASS bindet nun also Upf3a, das aus dem Zytoplasma ein Stückchen von der RNA mitgebracht hat, die gerade abgebaut wurde. Gemeinsam scannen sie über das Genom und finden Sequenzen, die der mitgebrachten Sequenz besonders ähnlich sind. Solche Sequenzen deuten auf eine gewisse Verwandtschaft eines Gens mit jenem Gen hin, dessen RNA aufgrund der Mutation abgebaut wurde und dessen Funktion also fehlt. Durch das Aktivieren genau solcher Gene können daher gezielt funktionsverwandte Gene raufreguliert werden, also stärker transkribiert werden. Und genau das führt zu einem Ausgleich der Funktion, die durch unsere Mutation betroffen war. Das ganze ist ein wirklich beeindruckender Mechanismus, den die Natur entwickelt hat um die Auswirkung der Mutation eines einzelnen Gens möglichst gut zu kompensieren.

Ergo: Mitdenken beim CRISPR-Design

Was bedeutet diese Erkenntnis nun für die Forscher? Nunja, man sollte einfach wirklich gut nachdenken, wenn man sein genetisches Werzeug, z.B. sein CRISPR/Cas9 System designt, also die target Sequenz auswählt. Wenn man beispielsweise eine einzelne bekannte Punktmutation, die im Menschen eine Krankheit hervorruft, im Tiermodell nachstellen will, dann sollte eben auch genau jene Mutation versuchen einzubringen. Sollte dadurch im Modelltier eine genetische Kompensation erfolgen, dann findet diese vermutlich auch im Menschen statt, wodurch man womöglich ein sehr gutes Krankheitsmodell erzeugt hat. Wenn man allerdings den kompletten Funktionsverlust eines Gens untersuchen will und dabei keine etwaigen Kompensationsmechanismen hervorrufen will, dann sollte man eben nicht eine premature STOP Codon in einem der vorderen Exons erzeugen. Eine Alternative wäre es zum Beispiel das CRISPR System so zu programmieren, dass ein komplettes Exon, auf dem wichtige Abschnitte des Protein codiert sind, verloren geht. Etliche Forschungslabore dieser Welt sind dank dieser beiden Arbeiten wohl gerade dabei, ihre CRISPR knock-out Strategie zu überdenken.

 

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